液相方法开发时不同的方法需要不同的策略

图1. 保留因子、拖尾因子、分离度及理论板数的计算。

几乎每一个色谱工作者都做过液相方法开发的工作。不管你的工作是要对一个常规的方法进行偶尔的调整，进而建立一个一次性的方法来支持化学合成，还是需要采用一个成熟的方法来进行生产过程的检测，对液相方法开发原则的深刻理解都是很有价值的。

根据经验，“完美”的液相方法是不存在的，每一个方法都可以做得更好。“没有最好，只有更好”只是方法开发的首要原则，要想让方法做得更好一点，随之花费的时间可能是分析人员所无法承受的，所以，开发一个适合于手边工作的方法即可。

目标是什么？

很多色谱工作者在进行方法开发项目开始，心中没有一个即使是模糊的目标，感觉工作最终是靠反复试验完成的，而不断试验常常会以反复失败结束，这样浪费了宝贵的时间和金钱。但大部分人都没有大量多余的时间，可以花费在探究导致偏离目标的可能性上，所以都需要一个目标，这个目标根据不同情况也有差异。如果想快速检测合成产物的纯度，那么通常30min梯度洗脱的方法就可以做这项工作，不需要投入再多。相反，如果你的方法是要对10000个临床研究样品进行技术支持的话，那么将运行时间从6min减少到4min会是你值得去做的事情。下面所列的是用在液相方法开发中的一些因素，希望可以帮助你确定目标：样品数量；运行时间；被分析物数量；基质的数量；灵敏度；重复性；精密度和准确度；浓度范围；定性和定量；仪器及操作限制；样品制备要求；验证要求。

当然，影响液相方法开发的因素有很多，没有必要去详细讨论每一个因素，这里举几个例子。在溶出度试验中，有两个需要定量的活性成分，它们的浓度为mg/ml，如果通过观察稳定性指示的检测或杂质分布图进行，其中破坏性降解的样品能产生5~30个峰，其中一些峰面积可以是主成分色谱峰面积的0.05%~0.1%。在后一种情况中，分离会比前者更具挑战性，所以你可以以一个有更强分辨率的试验性方案开始。但将能想到的很多方法特征列出来确是一个不错的想法。如果一个新的方法是对以前方法的修饰或与其它方法相似，你可以采用现有方法中的性能指标作为方法开发的起点。

方法完成的确定

你需要有一种方式来量度方法开发的终点，以便不会落入“只是多一次实验”的陷阱，使方法开发的过程没有必要的延长。你需要一些定量指标来量化所开发的可以应用的方法，方式之一是遵循管理机构的建议。例如，美国食品药品管理局药物评价与研究中心（FDA-CDER）出版的“指导原则”可有计划地去帮助他们的职员依据法规审查色谱方法的性能。其中之一就是色谱方法的验证的指导原则 。这不是一个法律或政策，但它给予了我们一个好的概念，即检查员将查看方法的哪些方面。四个定量的标准即为保留因子k（在文件中为容量因子k'），拖尾因子Tf （文件中为T），分离度Rs，理论板数N，这些都是非常好的评价任何分离效果的指标，同时也是建立用于在运行批样品测试方法之前的系统适用性试验的核心指标。

K=（tR-t0）/t0 ［1］

保留因子是衡量样品在固定相和流动相之间分配的指标，但是从实际经验来看是用其它方式来衡量保留行为。

其中tR及t0相应为保留时间及死时间。如图1所示，死时间常常以不保留化合物进样或以基线的最先波动来判定，通常认为是溶剂峰。保留时间是指进样直峰最大的时间，理论上说，对于最好的色谱性能，所有色谱峰能在2